Kwantificering NAD+ en zijn metabolieten in ischiaszenuwen van muizen

Introductie

De cruciale delen van nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) en zijn metabolieten bij veroudering en neurodegeneratie zijn algemeen erkend. Om vooruitgang te boeken in de richting van biochemisch onderzoek en interventies gericht op veroudering en neurodegeneratieve ziekten, is het van groot belang om NAD+ en zijn metabolietniveaus in de NAD+-bergingsroute nauwkeurig te kwantificeren. Hier wordt een robuuste en nauwkeurige LC-MS/MS-methode toegepast om NAD+ en zijn metabolietniveaus in normale en gewonde heupzenuw van muizen te kwantificeren.

Beperkingen van bestaande methoden voor het kwantificeren van NAD+ en zijn metabolieten

Traditionele methoden voor het kwantificeren van NAD+ en zijn metabolieten, zoals HPLC-UV, NMR, capillaire zone-elektroforese of colorimetrische enzymatische assays, worden geconfronteerd met verschillende uitdagingen op het gebied van gevoeligheid, selectiviteit en indirecte meting. Wat betreft bestaande LC-MS/MS-assays voor cellulaire of weefsel-NAD+ en zijn metabolietenmetingen, zijn er nog steeds veel problemen die moeten worden overwonnen, zoals langere looptijden, slecht chromatografisch retentiegedrag en onbevredigende piekvormen. Bovendien kunnen slechts één tot drie stoffen in de NAD+ bergingsroute door deze methoden worden bestreken.

De modificaties van de LC-MS/MS-methode

Op basis van bestaande LC-MS/MS-assays worden de modificaties met betrekking tot de chromatografische condities, surrogaatmatrix en MS/MS-condities uitgevoerd. In het bijzonder wordt 5 μM methyleenfosfonzuur gebruikt als het mobiele fase-additief, dat expliciet de signaalintensiteit en piekvorm bevordert. Gezien de relatief schone en eenvoudige aard van nooit-monsters en hun kleine formaat, wordt ultrapuur water getest als een vervangende matrix. In plaats van hydrofiele interactie vloeistofchromatografiekolom en hypercarb-kolom, wordt de Waters Atlantis Premier BEH C18 AX-kolom gebruikt, waarvan de unieke MaxPeak HPS high-performance oppervlaktetechnologie (passivatie van de binnenwand van de kolom, eliminatie van metalen oppervlak) de hoge reproduceerbaarheid, pieksymmetrie en basislijnscheiding van alle analyten mogelijk maakt.Bovendien zijn de MS-omstandigheden geoptimaliseerd om het NAD+-interferentiesignaal in het cyclische adenosinedifosfaatribose (cADPR)-kanaal te minimaliseren met behoud van de respons van cADPR en nicotinamide-mononucleotide (NMN), met 4000V voor ionensproeispanning, 450°C voor turboverwarmingstemperatuur, 50 psi voor Gas 1, 50 psi voor Gas 2, 30 psi voor gordijngas en 12 psi voor botsingsgas.

Representatief chromatogram van zenuwmonsters (normaal versus gewond)

Alle vijf analyten bereiken baseline-scheiding, waarbij cADPR een gevoelige biomarker is in het neurodegeneratiemodel. Hierbij induceert axonale degeneratie van de heupzenuw, wat leidt tot een verlaagd NAD+-niveau en een verhoogd NMN-niveau in de gewonde zenuwen, wat resulteert in een ongeveer 2-voudige toename van de NMN/NAD+-verhouding. Tegelijkertijd worden de niveaus van nicotinamide (NAM) en adenosinedifosfaatribose (ADPR) met ongeveer 2-voudig verlaagd, terwijl het cADPR-niveau met meer dan 8-voudig wordt verhoogd. Deze resultaten komen overeen met die van eerder gerapporteerd onderzoek, waarbij de nauwkeurigheid van deze gemodificeerde LS-MS/MS-methode bij het kwantificeren van NAD+ en zijn metabolieten wordt geverifieerd.

Conclusie

Deze aangepaste LC-MS/MS-methode maakt een effectieve baselinescheiding van NAD+, NMN, NAM, ADPR en cADPR mogelijk binnen een korte looptijd van 5 minuten, wat bijdraagt aan vroege diagnoses van verschillende neurologische aandoeningen en de ontwikkeling van geneesmiddelen voor veroudering en neurodegeneratieve ziekten.

Referentie

Ma Y, Deng L, Du Z. Ontwikkeling en validatie van een LC-MS/MS-methode voor het kwantificeren van NAD+ en verwante metabolieten in ischiaszenuwen bij muizen en de toepassing ervan op een diermodel voor zenuwletsel. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821

BONTAC NAD

Bontacis sinds 2012 toegewijd aan de R&D, productie en verkoop van grondstoffen voor co-enzym en natuurlijke producten, met eigen fabrieken, meer dan 170 wereldwijde patenten en een sterk R&D-team. BONTAC heeft een rijke R&D-ervaring en geavanceerde technologie in de biosynthese vanNAD en zijn voorlopers(bijv. NMN en NR). Er zijn verschillende soorten NAD te selecteren, waaronder NAD ER Grade (endoxine verwijdering), NAD Grade I (IVD/voedingssupplement/cosmetica ruw poeder), NAD Grade II (API/tussenproducten) en NAD Grade IV (indien er hogere eisen worden gesteld aan de oplosbaarheid), die kunnen worden geleverd in de vorm van gevriesdroogd poeder of kristallijn poeder. De zuiverheid van BONTAC NAD kan oplopen tot meer dan 98%.

Disclaimer

Dit artikel is gebaseerd op de referentie in het wetenschappelijke tijdschrift. De relevante informatie wordt alleen verstrekt voor deel- en leerdoeleinden en vertegenwoordigt geen medisch advies. Als er sprake is van een inbreuk, neem dan contact op met de auteur voor verwijdering. De standpunten in dit artikel vertegenwoordigen niet het standpunt van BONTAC. BONTAC kan in geen geval op enigerlei wijze verantwoordelijk of aansprakelijk worden gesteld voor claims, schade, verliezen, uitgaven of kosten die direct of indirect voortvloeien uit of voortvloeien uit uw vertrouwen op de informatie en het materiaal op deze website.