De optimalisatie van reactiecondities om een hoge opbrengst van Stevia Rebaudioside D te bereiken
Diëten met een hoog suikergehalte hebben geleid tot een stijgende prevalentie van verschillende chronische ziekten, waaronder obesitas, diabetes, hart- en vaatziekten en hypertensie, die een aanzienlijk wereldwijd probleem voor de volksgezondheid vormen. Stevia Rebaudioside D (Reb D), een natuurlijke zoetstof afgeleid van planten, heeft veel aandacht gekregen als suikervervanger vanwege het calorievrije gehalte, de intense zoetheid en het aangename smaakprofiel.
De beperkte aanwezigheid in stevia rebaudiana Bertoni en uitdagingen in verband met lage oplosbaarheid en enzymatische activiteit van plantaardige glycosyltransferase hebben de wijdverspreide commerciële toepassing ervan echter belemmerd. Als reactie op deze problemen werd een nieuw glycosyltransferase genaamd YojK ontdekt, afkomstig van Bacillus subtilis 168. Deze studie introduceert een genetisch gemodificeerd bacterieel glycosyltransferase, YojK-I241T/G327N, gekenmerkt door hoge oplosbaarheid en katalytische efficiëntie, met een groot potentieel voor de productie van Reb D op industriële schaal.
De ontwikkeling van een zeer efficiënte methode voor de productie van rebaudioside D met behulp van een cascadereactie van YojK-I241T/G327N en AtSuSy enzymen.
Om het probleem van lage oplosbaarheid in plantaardige glycosyltransferasen aan te pakken, onderzochten onderzoekers het potentieel van het gebruik van YojK, een O-glycosyltransferase van Bacillus subtilis 168. YojK werd gekozen vanwege de aangetoonde glycosyleringsactiviteit met verschillende substraten, waaronder grote moleculen. Na succesvolle recombinante expressie en zuivering werd YojK gebruikt om Reb A te glycosyleren, wat resulteerde in de productie van Stevia Reb D. Enzymkinetische analyse onthulde dat YojK een lagere katalytische activiteit heeft in de richting van Reb D in vergelijking met andere glycosyltransferasen. Bijgevolg suggereert de studie de noodzaak van structuurgestuurde engineering om de katalytische activiteit van YojK te verbeteren voor potentiële praktische toepassingen. (zoals weergegeven in figuur 1)
Figuur 1
De optimalisatie van reactiecondities om een hoge opbrengst van rebaudioside D te bereiken.
De reactieomstandigheden, waaronder pH, temperatuur en substraatconcentratie, kunnen worden geoptimaliseerd om een hoge opbrengst van Srevia Reb D te bereiken. De studie gebruikte moleculaire dynamicasimulaties om te onderzoeken hoe de YojK-I241T / G327N-variant Reb D-glycosylatie verbetert. De variant behield een stabiele waterstofbrug tussen Reb A en H14 tijdens simulaties, in tegenstelling tot het wild-type (zoals weergegeven in figuur 2). Deze stabiliteit strekte zich ook uit tot de afstand tussen het O2-atoom van Reb A en het C1P van UDPG. De verbeterde katalytische efficiëntie van de YojK-I241T/G327N-variant werd toegeschreven aan deze stabiele interacties, wat het praktische potentieel ervan suggereert.
Figuur 2
Figuur 3
Conclusie
Deze aanpak leverde 83,47% Reb D op. Met name het toevoegen van 1 mM UDPG maakte de synthese van 20,59 g / L Reb D mogelijk met een opmerkelijke opbrengst van 91,29%, waarmee eerdere studies werden overtroffen. Dit proces toont het potentieel voor Reb D-productie op industriële schaal, vooral na structurele engineering van YojK.YojK kan efficiënt worden uitgedrukt in E. coli BL21 (DE3) met een hoge oplosbaarheid. Door middel van structuurgestuurde engineering werd een dubbele mutant, YojK-I241T / G327N, gecreëerd, die de grootschalige productie van Reb D met een uitzonderlijke opbrengst van 91,29% mogelijk maakt door UDPG te recyclen gekatalyseerd door sucrosesynthase AtSuSy. Deze studie presenteert YojK-I241T/G327N als een veelbelovend hulpmiddel voor economisch effectieve Reb D-productie op industriële schaal.
