Groeigekoppelde enzymengineering door manipulatie van redoxcofactorregeneratie

Een steeds breder scala aan chemicaliën wordt nu via biotechnologische middelen geproduceerd uit hernieuwbare grondstoffen. Bioprocessen zijn sterk afhankelijk van enzymatische katalyse voor de efficiënte productie van deze verbindingen. Het waarborgen dat enzymen optimaal functioneren in hun benodigde omgeving is daarom van groot belang voor duurzame productie.

Eigenschappen zoals substraatspecificiteit, katalytische snelheid en (thermo)stabiliteit behoren tot de belangrijkste factoren die geoptimaliseerd moeten worden voor efficiënte enzym-gedreven bioprocessen. Deze optimalisatie kan tijdrovend, kostbaar en uitdagend zijn, en daarom effectieve en kostenefficiënte manieren voor groei-gekoppelde selectie; het ingenieuren van enzymen met gewenste eigenschappen is zeer gewild.

De voordelen van het gebruik van groeigekoppelde selectie als een vorm van enzymselectie, waarbij de activiteit van een enzym wordt gekoppeld aan de groei van een cel. Deze methode kan worden gebruikt als een selectiestrategie met hoge doorvoer, en kan worden bereikt door ervoor te zorgen dat groei afhankelijk is van productsynthese door het doel-enzym, of door de activiteit van het enzym te koppelen aan de globale energietoestand van de cel. Synthetische biologie kan worden gebruikt om stammen te ontwikkelen die geschikt zijn voor groeigekoppelde selectie, en recente ontwikkelingen richten zich op het technisch maken van stammen die een tekort hebben aan geoxideerde of gereduceerde toestanden van redoxcofactorparen, die kunnen dienen als enzymengineeringplatforms. Het gebruik van deze platforms kan de ontwikkeling van verbeterde biokatalysatoren en bioprocessen versnellen.

Voordelen van groeikoppeling via cofactor-auxotrofie

De voordelen van het gebruik van cofactor-auxotrofie als selectiemethode voor het manipuleren van enzymen die betrokken zijn bij de biosynthese van bepaalde chemicaliën, zoals lipiden, biobrandstoffen, gassen, organische oplosmiddelen of polymere verbindingen. Deze aanpak biedt verschillende unieke voordelen, waaronder de mogelijkheid om het gewenste product onafhankelijk van het substraat of product van interesse te selecteren, waardoor verbeterde enzymatische activiteit gemakkelijker kan worden gedetecteerd en een uitlezing wordt geboden voor het detecteren van verbeterde enzymatische activiteit. Daarnaast is het gebruik van cofactor-auxotrofen als groeikoppelingsplatforms gunstig, omdat de alomtegenwoordige aard van redoxcofactoren in microbiële stofwisseling betekent dat engineeringstrategieën lateraal overdraagbaar kunnen zijn naar andere microben van belang, en enzymen direct kunnen worden gemodificeerd binnen de omgeving van de gewenste microbiële gastheer. (weergegeven als figuur 1)

Figuur 1: Vergelijking van verschillende veelgebruikte screenings-/selectietechnieken voor enzymengineering

Mutanten die een tekort hebben aan NADH-oxidatie

De oxidatie van NADH in E. coli kan via twee routes plaatsvinden, afhankelijk van de beschikbaarheid van zuurstof. Onder aerobe omstandigheden wordt NADH voornamelijk geoxideerd door ademhaling om ATP te produceren, terwijl het onder anaerobe omstandigheden via fermentatieroutes kan worden geoxideerd om lactaat en ethanol te produceren. Mutante stammen van E. coli, die geen gemengde fermentatieroutes kunnen gebruiken voor NADH-oxidatie tijdens anaerobe groei, zijn gebruikt om NADH-oxidatieroutes aan te sturen voor de anaërobe synthese van verschillende chemicaliën, zoals 2-methylpropan-1-ol, 2,3-butanediol, 1-butanol en L-alanine. Deze mutante stammen zijn ook gebruikt om enzymen te ontwikkelen door gebruik te maken van vergelijkbare redoxprincipes, wat resulteerde in verbeterde varianten. De resulterende stammen kunnen worden gebruikt om andere NAD(P)H-afhankelijke enzymen en routes te engineeren.

Mutanten die een tekort hebben aan NAD+-reductie  

Wenk et al. creëerden een E. coli-stam door het dihydrolipoyldehydrogenase (lpd)-gen te verwijderen, wat ertoe leidde dat de stam geen reducerende energie (NADH en NADPH) uit acetaatmetabolisme kon genereren vanwege de afwezigheid van pyruvatdehydrogenase-activiteit. Hierdoor toonde de stam auxotrofie om het vermogen te verminderen wanneer het akroob op acetaat als enige koolstofbron werd gekweekt. (weergegeven als figuur 2) De stam kon op acetaat groeien wanneer deze werd aangevuld met bovenste glycolytische substraten of bij het tot expressie van NAD+-afhankelijke formiët-, ethanol- of methanoldehydrogenasen met hun respectievelijke substraten. De stam werd niet gebruikt voor enzymengineering en werd alleen beoordeeld op redox cofactor auxotrofie.
 

Figuur 2: Centraal metabolisme 

Mutanten die een tekort hebben aan NADPH-oxidatie

Er zijn twee verschillende strategieën om NADP+-auxotrofie in E. coli op te wekken, waarbij het glycolytische pad wordt gemanipuleerd om NADPH te overproduceren. De eerste strategie houdt in het verwijderen van het native gapA-gen en het tot expressie brengen van een heteroloog NADP+-afhankelijk GAPDH-enzym, terwijl de tweede strategie het omleiden van de koolstofflux via de pentosefosfaatroute. De resulterende stammen kunnen niet groeien op glucose, maar vertonen groei onder andere omstandigheden, waarbij de eerste stam onder anaerobe omstandigheden wordt gekweekt en de tweede onder aerobe omstandigheden met glycerol als substraat. Deze stammen worden gebruikt voor het ontwikkelen van enzymen met verbeterde eigenschappen, waaronder substraatspecificiteit, katalytische activiteit en thermostabiliteit.

Mutanten met een tekort aan NADP+-reductie

Drie verschillende bacteriën, E. coli, P. putida en C. glutamicum, zijn gemodificeerd om NADPH-auxotroof te zijn, wat betekent dat ze exogeen NADPH nodig hebben voor groei. In het geval van E. coli en C. glutamicum werden centrale metabole enzymen uitgeschakeld om NADP+-reductie te voorkomen wanneer glucose als koolstofbron werd geleverd, terwijl bij P. putida CRISPR/nCas9-ondersteunde engineering werd gebruikt om sets van doelgenen sequentieel te verstoren om hun betrokkenheid bij het redoxmetabolisme te begrijpen. De NADPH-auxotrofe stammen werden vervolgens gebruikt voor groeigekoppelde enzymengineering op basis van cofactorspecificiteit. Een enkele ronde mutagenese met E. coli leverde tot nu toe de meest efficiënte en specifieke NADP+-afhankelijke formiate-dehydrogenase op, terwijl P. putida en C. glutamicum de eerste stammen van hun soort zijn die voor dit type engineering gebruikt kunnen worden.

Mutanten die een tekort hebben aan NMN+-reductie

Er werd een groeigekoppeld selectiesysteem ontwikkeld om cofactorcyclus en groei te koppelen op basis van een tekort aan NMN+-reductie. De E. coli SHuffle-stam werd gebruikt, die deleties draagt in twee genen die betrokken zijn bij de productie van gereduceerd glutathion. Een NMNH-afhankelijke glutathionreductase werd ontwikkeld via rationele mutagenese om het proces te koppelen aan NMN+/NMNH-cyclie, en een NMN+-afhankelijke glucosedehydrogenase werd gebruikt ter ondersteuning van NMN+/NMNH cofactorcyclus en dus groei. De studie paste ook voor het eerst niet-canonieke redoxcofactor auxotrofie toe voor groeigekoppelde enzymengineering, wat resulteerde in een thermostabiele fosfietdehydrogenasevariant met verbeterde katalytische efficiëntie en temporele stabiliteit in vitro. Het werk biedt een nuttige stam voor groeigekoppelde enzymengineering, afhankelijk van NMN+/NMNH-cyclus en auxotroof voor de verminderde toestand van een niet-canonieke redoxcofactor.

Het potentieel van groeikoppeling via redoxcofactoren werkte als een krachtig hulpmiddel om biokatalysatoren te ontwikkelen, vooral in de context van duurzame bioproductie. Hoewel er aanzienlijke vooruitgang is geboekt bij de generatie van redoxcofactor auxotrofe stammen, suggereert de verklaring dat er nog verschillende onontgonnen onderzoeksmogelijkheden zijn. Een daarvan betreft het ontwerpen van cofactor-auxotrofe stammen van organismen anders dan E. coli, wat nieuwe mogelijkheden kan openen voor groeigekoppelde enzymengineering.

Al met al suggereert het dat het gebruik van op redox cofactoren gebaseerde groeikoppeling een grote kans biedt voor engineering biokatalyse, met name voor de productie van producten die niet voldoen aan de eisen van andere high-throughput enzym engineering-methoden. Het benadrukt de noodzaak om veelzijdigere en efficiëntere biokatalysatoren te ontwikkelen voor duurzame bioproductie en benadrukt het belang van voortgezet onderzoek op dit gebied.


Referentie: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Groeigekoppelde enzymengineering door manipulatie van redoxcofactorregeneratie, Biotechnology Advances, 2023.