Kwantificatie van NAD+ en zijn metabolieten in heupzenuwen van muizen
Inleiding
De cruciale rol van nicotinamide-adenine-dinucleotide (NAD+) en zijn metabolieten bij veroudering en neurodegeneratie wordt algemeen erkend. Om de vooruitgang in biochemisch onderzoek en interventies gericht op veroudering en neurodegeneratieve ziekten te stimuleren, is het van groot belang om NAD+ en de niveaus van zijn metabolieten in de NAD+-reddingsroute nauwkeurig te kwantificeren. Hierbij wordt een robuuste en nauwkeurige LC-MS/MS-methode toegepast om NAD+ en de niveaus van zijn metabolieten te kwantificeren in normale en beschadigde nervus ischiadicus van muizen.Beperkingen van bestaande methoden voor het kwantificeren van NAD+ en zijn metabolieten
Traditionele methoden voor het kwantificeren van NAD+ en zijn metabolieten, zoals HPLC-UV, NMR, capillaire zone-elektroforese of colorimetrische enzymatische assays, worden geconfronteerd met verschillende uitdagingen op het gebied van gevoeligheid, selectiviteit en indirecte meting. Wat betreft bestaande LC-MS/MS-assays voor het meten van NAD+ en zijn metabolieten in cellen of weefsels, zijn er nog veel moeilijkheden te overwinnen, zoals langere analysetijden, slecht chromatografisch retentiegedrag en onbevredigende piekvormen. Bovendien kunnen met deze methoden slechts één tot drie stoffen in de NAD+-reddingsroute worden gedekt.De aanpassingen van de LC-MS/MS-methode
Op basis van bestaande LC-MS/MS-assays worden aanpassingen uitgevoerd met betrekking tot de chromatografische omstandigheden, surrogaatmatrix en MS/MS-omstandigheden. Specifiek wordt 5 μM methyleenfosfonzuur gebruikt als additief voor de mobiele fase, wat de signaalintensiteit en piekvorm expliciet bevordert. Gezien de relatief schone en eenvoudige aard van zenuwmonsters en hun kleine omvang, wordt ultrapuur water getest als vervangende matrix. In plaats van een hydrofiele interactie-vloeistofchromatografiekolom en hypercarb-kolom wordt de Waters Atlantis Premier BEH C18 AX-kolom gebruikt, waarvan de unieke MaxPeak HPS high-performance oppervlaktetechnologie (het passiveren van de binnenwand van de kolom, het elimineren van metalen oppervlak) zorgt voor hoge reproduceerbaarheid, pieksymmetrie en basislijnscheiding van alle analieten.Bovendien worden de MS-omstandigheden geoptimaliseerd om het NAD+-interferentiesignaal in het cyclisch adenosine-difosfaat-ribose (cADPR)-kanaal te minimaliseren, terwijl de respons van cADPR en nicotinamide-mononucleotide (NMN) behouden blijft, met 4000V voor de ionisatiespanning, 450℃ voor de turboverwarmertemperatuur, 50 psi voor Gas 1, 50 psi voor Gas 2, 30 psi voor curtain gas en 12 psi voor botsingsgas.
Representatief chromatogram van zenuwmonsters (normaal versus beschadigd)
Alle vijf analieten bereiken basislijnscheiding, waarbij cADPR een gevoelige biomarker is in het neurodegeneratiemodel. Hierbij induceert axotomie van de nervus ischiadicus axonale degeneratie, wat leidt tot een verlaagd NAD+-niveau en een verhoogd NMN-niveau in de beschadigde zenuwen, resulterend in een ongeveer 2-voudige toename van de NMN/NAD+-verhouding. Tegelijkertijd worden de niveaus van nicotinamide (NAM) en adenosine-difosfaat-ribose (ADPR) met ongeveer 2-voudig verlaagd, terwijl het cADPR-niveau met meer dan 8-voudig wordt verhoogd. Deze resultaten komen overeen met die van eerder gerapporteerd onderzoek, wat de nauwkeurigheid van deze aangepaste LC-MS/MS-methode voor het kwantificeren van NAD+ en zijn metabolieten bevestigt.
Conclusie
Deze aangepaste LC-MS/MS-methode maakt een effectieve basislijnscheiding van NAD+, NMN, NAM, ADPR en cADPR mogelijk binnen een korte analysetijd van 5 minuten, wat bijdraagt aan vroege diagnoses van verschillende neurologische aandoeningen en de ontwikkeling van geneesmiddelen voor veroudering en neurodegeneratieve ziekten.Referentie
Ma Y, Deng L, Du Z. Ontwikkeling en validatie van een LC-MS/MS-methode voor het kwantificeren van NAD+ en gerelateerde metabolieten in nervus ischiadicus van muizen en de toepassing ervan op een diermodel voor zenuwbeschadiging. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACis sinds 2012 toegewijd aan de R&D, productie en verkoop van grondstoffen voor co-enzymen en natuurlijke producten, met eigen fabrieken, meer dan 170 wereldwijde patenten en een sterk R&D-team. BONTAC heeft uitgebreide R&D-ervaring en geavanceerde technologie op het gebied van de biosynthese vanNAD en zijn precursors(bijv. NMN en NR). Er zijn verschillende soorten NAD om uit te kiezen, waaronder NAD ER Grade (endoxineverwijdering), NAD Grade I (IVD/voedingssupplement/cosmetica-grondpoeder), NAD Grade II (API/tussenproducten) en NAD Grade IV (indien er hogere eisen aan de oplosbaarheid zijn), die kunnen worden geleverd in de vorm van gevriesdroogd poeder of kristallijn poeder. De zuiverheid van BONTAC NAD kan meer dan 98% bereiken.
