Kwantificatie van NAD+ en de metabolieten in de ischiaszenuwen van de muis
Inleiding
De cruciale onderdelen van nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) en de metabolieten ervan bij veroudering en neurodegeneratie zijn breed erkend. Om vooruitgang te stimuleren richting biochemisch onderzoek en interventies gericht op veroudering en neurodegeneratieve ziekten, is het van groot belang om NAD+ en de metabolietniveaus in de NAD+ salvageroute nauwkeurig te kwantificeren. Hier wordt een robuuste en nauwkeurige LC-MS/MS-methode toegepast om NAD+ en de metabolietenniveaus in normale en beschadigde muisischiaszenuw te kwantificeren.Beperkingen van bestaande methoden voor het kwantificeren van NAD+ en zijn metabolieten
Traditionele methoden voor het kwantificeren van NAD+ en zijn metabolieten, zoals HPLC-UV, NMR, capillaire zone-elektroforese of colorimetrische enzymatische assays, staan voor diverse uitdagingen op het gebied van gevoeligheid, selectiviteit en indirecte metingen. Wat betreft bestaande LC-MS/MS-tests voor cellulaire of weefsel NAD+ en de metabolietmetingen daarvan, zijn er nog veel moeilijkheden te overwinnen, zoals verlengde looptijden, slecht chromatografisch retentiegedrag en onbevredigende piek-vormen. Bovendien kunnen slechts één tot drie stoffen in het NAD+ salvageproces met deze methoden worden behandeld.De aanpassingen van de LC-MS/MS-methode
Op basis van bestaande LC-MS/MS-assays worden aanpassingen uitgevoerd met betrekking tot de chromatografische voorwaarden, surrogaatmatrix en MS/MS-condities. Specifiek wordt 5 μM methyleenfosfonzuur gebruikt als mobiele faseadditief, wat expliciet de signaalintensiteit en piekvorm bevordert. Gezien de relatief schone en eenvoudige aard van nooit-monsters en hun kleine grootte, wordt ultrazuiver water getest als een vervangende matrix. In plaats van hydrofiele interactie vloeistofchromatografiekolom en hypercarbkolom wordt de Waters Atlantis Premier BEH C18 AX-kolom gebruikt, waarvan de unieke MaxPeak HPS high-performance oppervlaktetechnologie (het passiveren van de kolombinnenwand, het elimineren van metaaloppervlak) de hoge reproduceerbaarheid, pieksymmetrie en basislijn-scheiding van alle analyten mogelijk maakt. Daarnaast zijn MS-condities geoptimaliseerd om het NAD+ interferentiesignaal in het cyclische adenosine difosfaat ribose (cADPR) kanaal te minimaliseren, terwijl de respons van cADPR en nicotinamide mononucleotide (NMN) behouden blijft, met 4000V voor ionensproeispanning, 450°C voor turboverwarmertemperatuur, 50 psi voor gas 1, 50 psi voor gas 2, 30 psi voor gordijngas en 12 psi voor botsinggas.
Representatief chromatogram van zenuwmonsters (normaal versus gewond)
Alle vijf de analyten bereiken een baseline-scheiding, waarbij cADPR een gevoelige biomarker is in het neurodegeneratiemodel. Hierin induceert de ischiaszenuwaxotomie axonale degeneratie, wat leidt tot een verlaagd NAD+-niveau en een verhoogd NMN-niveau in de beschadigde zenuwen, wat resulteert in een ongeveer tweevoudige toename van de NMN/NAD+-verhouding. Tegelijkertijd worden de niveaus van nicotinamide (NAM) en adenosinedifosfaatribose (ADPR) ongeveer twee keer verlaagd, terwijl het cADPR-niveau meer dan acht keer toeneemt. Deze resultaten komen overeen met die van eerder gerapporteerd onderzoek, wat de nauwkeurigheid van deze aangepaste LS-MS/MS-methode bij het kwantificeren van NAD+ en zijn metabolieten verifiëren.
Conclusie
Deze aangepaste LC-MS/MS-methode maakt effectieve basisscheiding mogelijk van NAD+, NMN, NAM, ADPR en cADPR binnen een korte looptijd van 5 minuten, wat bijdraagt aan vroege diagnoses van diverse neurologische aandoeningen en de ontwikkeling van geneesmiddelen voor verouderings- en neurodegeneratieve ziekten.Referentie
Ma Y, Deng L, Du Z. Ontwikkeling en validatie van een LC-MS/MS-methode voor het kwantificeren van NAD+ en gerelateerde metabolieten in de ischiaszenuwen van muizen en de toepassing ervan op een diermodel met zenuwletsel. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACis sinds 2012 toegewijd aan R&D, productie en verkoop van grondstoffen voor co-enzymen en natuurlijke producten, met zelfstandige fabrieken, meer dan 170 wereldwijde patenten en een sterk R&D-team. BONTAC beschikt over rijke R&D-ervaring en geavanceerde technologie in de biosynthese vanNAD en haar voorlopers(bijv. NMN en NR). Er zijn verschillende soorten NAD die geselecteerd moeten worden, waaronder NAD ER Grade (endoxineverwijdering), NAD Grade I (IVD/voedingssupplement/cosmetica ruwe poeder), NAD Grade II (API/intermediairen) en NAD Grade IV (indien er hogere eisen zijn aan oplosbaarheid), die kunnen worden geleverd in de vorm van gelyofilieerd poeder of kristallijn poeder. De zuiverheid van BONTAC NAD kan boven de 98% uitkomen.
