De optimalisatie van reactiecondities om een hoge opbrengst van stevia rebaudioside D te bereiken
Suikerrijke diëten hebben geleid tot een toenemende prevalentie van verschillende chronische ziekten, waaronder obesitas, diabetes, hart- en vaatziekten en hoge bloeddruk, wat een aanzienlijk wereldwijd volksgezondheidsprobleem vormt. Stevia Rebaudioside D (Reb D), een natuurlijke zoetstof afkomstig van planten, heeft veel aandacht gekregen als suikervervanger vanwege het calorievrije gehalte, de intense zoetheid en het aangename smaakprofiel.
De beperkte aanwezigheid in stevia rebaudiana Bertoni en uitdagingen gerelateerd aan de lage oplosbaarheid en enzymatische activiteit van plantafgeleide glycosyltransferase hebben echter de brede commerciële toepassing belemmerd. Als reactie op deze problemen werd een nieuwe glycosyltransferase genaamd YojK ontdekt, afkomstig van Bacillus subtilis 168. Deze studie introduceert een genetisch gemodificeerde bacteriële glycosyltransferase, YojK-I241T/G327N, gekenmerkt door hoge oplosbaarheid en katalytische efficiëntie, wat grote potentie biedt voor industriële productie van Reb D.
De ontwikkeling van een zeer efficiënte methode voor de productie van rebaudioside D met behulp van een cascade-reactie van YojK-I241T/G327N en AtSuSy-enzymen.
Om het probleem van lage oplosbaarheid in plantafgeleide glycosyltransferasen aan te pakken, onderzochten onderzoekers het potentieel van het gebruik van YojK, een O-glycosyltransferase uit Bacillus subtilis 168. YojK werd gekozen vanwege de aangetoonde glycosyleringsactiviteit met verschillende substraten, waaronder grote moleculen. Na succesvolle recombinante expressie en zuivering werd YojK ingezet om Reb A te glycosyleren, wat resulteerde in de productie van Stevia Reb D. Enzymkinetische analyse toonde aan dat YojK een lagere katalytische activiteit heeft richting Reb D in vergelijking met andere glycosyltransferases. Daarom suggereert de studie de noodzaak van structuurgeleide engineering om de katalytische activiteit van YojK te verbeteren voor mogelijke praktische toepassingen. (zoals weergegeven in Figuur 1)
Figuur 1
De optimalisatie van reactiecondities om een hoge opbrengst van rebaudioside D te bereiken.
De reactieomstandigheden, waaronder pH, temperatuur en substraatconcentratie, kunnen worden geoptimaliseerd om een hoge opbrengst van Srevia Reb D te bereiken. De studie gebruikte moleculaire dynamica-simulaties om te onderzoeken hoe de YojK-I241T/G327N-variant de Reb D-glycosylering versterkt. De variant handhaafde een stabiele waterstofbinding tussen Reb A en H14 tijdens simulaties, in tegenstelling tot het wildtype (zoals weergegeven in Figuur 2). Deze stabiliteit strekte zich ook uit tot de afstand tussen het O2-atoom van Reb A en het C1P van UDPG. De verbeterde katalytische efficiëntie van de YojK-I241T/G327N-variant werd toegeschreven aan deze stabiele interacties, wat wijst op het praktische potentieel ervan.
Figuur 2
Figuur 3
Conclusie
Deze benadering leverde 83,47% Reb D op. Opmerkelijk is dat het toevoegen van 1 mM UDPG de synthese van 20,59 g/L Reb D mogelijk maakte met een opmerkelijke opbrengst van 91,29%, waarmee eerdere studies werden overtroffen. Dit proces toont het potentieel aan voor industriële productie van Reb D, vooral na de structurele engineering van YojK.YojK kan efficiënt worden tot expressie gebracht in E. coli BL21 (DE3) met hoge oplosbaarheid. Door structuurgeleide engineering werd een dubbele mutant gecreëerd, YojK-I241T/G327N, die de grootschalige productie van Reb D mogelijk maakte met een uitzonderlijke opbrengst van 91,29% door het recyclen van UDPG gekatalyseerd door sucrosesynthase AtSuSy. Deze studie presenteert YojK-I241T/G327N als een veelbelovend instrument voor economisch effectieve industriële productie van Reb D.
